作为一项“诺奖技术”，CRISPR 改变了科学家处理基因编辑的方式，提供了前所未有的简便和高效。

但是，CRISPR 技术并非万无一失，仍存在一定局限性，这让基因和细胞疗法从实验室跃升到临床成为一个很大的挑战。

先导型编辑(Prime editor，PE)的出现，可称得上是第三代基因组编辑技术，它能更精确、更高效地纠正特定核苷酸，同时把脱靶效应降到很低。

当下，基因突变引起的疾病治疗，特别是罕见病的治疗是学界关注的热点之一，而对于罕见病的治疗依旧是个大难题。

最近，上海科技大学生命科学与技术学院马涵慧团队研发出三款新型的先导型编辑器，可给解决上述难题带来新曙光。

先导编辑器不仅能够实现所有 12 种单碱基替换、以及小片段的插入和删除，并且具有很低的脱靶效应。被优化后的先导编辑器，是治疗这些基因突变疾病的强有力工具。

现在，学界已利用这种先导基因编辑方式对不少疾病相关的疾病突变修复进行深入研究，比如全身性神经节苷脂病(即 Tay-Sachs 病，一种与神经鞘脂代谢相关的隐性常染色体遗传病)。具体来说是利用先导编辑器在 HEXA 基因中插入 4bp 的序列构建突变模型，为后续进行基因治疗研究提供基础。

通过对 PRNP 引入一个位点突变，就可以是使人类和小鼠对朊病毒病具有抵抗力，利用先导编辑器在细胞水平中产生 G127V 突变等位基因，赋予对朊病毒的抗性。由此可以预见，先导编辑器具备强有力的应用价值。

近年来，核酸递送载体的开发与改进，让基因编辑工具体上应用成为可能，比如利用慢病毒递送系统可以将先导编辑器引入小鼠初级皮层神经元，为神经退行性疾病研究与治疗打下良好的基础。

马涵慧团队通过腺相关病毒载体、纳米脂质颗粒或其他合适的载体，将先导编辑器递送到模型动物、最终给药到病人体内靶向不同的器官，通过基因治疗的方法来解决这些难以治愈的遗传性疾病。

改进先导编辑器效率较低的问题

概括来说，此次工作主要改进了先导编辑器效率低的问题。而这一切要从 2019 年说起，当年哈佛大学和麻省理工学院布罗德研究所的教授刘如谦(David R. Liu)实验室开发出先导编辑器，实现了单碱基的 12 种替换，解决了单碱基基因编辑类型有限和避免旁观者编辑(bystander editing)的技术难题。同时，先导编辑器还可以实现小片段的插入与删除。

但是，先导编辑器在不同位点的基因编辑效率差别很大，绝大部分位点的编辑效率极低。

马涵慧团队猜测这可能和先导编辑器在活细胞内的分子动力学有关，比如先导编辑器的 RNA 组合 pegRNA 自身不稳定、非正常折叠导致 Cas9-pegRNA 复合物组装困难，或组装后的 Cas9-pegRNA 复合物对 DNA 靶向功能缺陷等。

为此，马涵慧团队使用其实验室之前开发的 CRISPRainbow 成像系统，对先导编辑器的目标 DNA 靶向效率进行测试，结果发现刘如谦实验室开发的先导编辑器靶向效率很低，这有可能是限制其编辑效率的原因。

接着，他们通过在 pegRNA 的 3 端添加 RNA 适配体构建了 3’带茎环结构的 sPEs (stem loop PEs)系统，同时在 Cas9 上连接了 RNA 适配体的结合蛋白构建了结合型 tPEs (Tethered PEs)系统。

这两种系统恢复了先导编辑器对目标 DNA 的靶向效率。研究中，该团队使用 sPEs 和 tPEs 对很多的基因位点的进行尝试，都可以提高基因编辑效率。

特别是对于一些难以编辑的位点，sPEs 和 tPEs 系统极大地提高了基因编辑效率。同时，他们也发现 sPEs 和 tPEs 系统几乎没有出现脱靶的现象。

为了让先导编辑器系统更加灵活，他们又将 pegRNA 拆分为 sgRNA 和 pRNA(prime RNA)，构建了双分子 RNA 的 SnPEs 系统。

SnPEs 系统能够使 Cas9 与 sgRNA 更好地组装，同时为先导编辑器增添更多改造的灵活性。目前马涵慧团队正在构建诱导型先导编辑系统(inducible PEs，iPEs)。

基因编辑效率和特异性是其在生物医学方面应用的两个关键因素，sPEs、tPE 效率的提高可以为其扩大应用范围，进一步开发的 iPEs 将使得基因编辑系统变得更加安全可控。

近日，相关论文以《利用拴系和拆分 pegRNA 提高先导编辑效率和灵活性》(Enhancing Prime Editing Efficiency and Flexibility with Tethered and Split pegRNAs)为题发在 Protein & Cell 上，上科大马涵慧实验室和华东理工大学肖啸实验室联合培养的博士研究生冯颖、上海科技大学研究生二年级学生刘思远为共同第一作者，马涵慧教授为通讯作者[

马涵慧表示：“审稿人对工作给予了高度评价。不过这个领域竞争比较激烈，在我们投稿这篇论文过程中，博德研究所的刘如谦实验室在《自然·生物技术》发表了类似于 sPEs 的 ePEgRNAs 系统的论文，麻省大学医学院的埃里克·桑蒂默(Erik Sontheimer)实验室在《自然·生物技术》发表了类似于 SnPEs 的 split prime editor 论文。”

因此在多轮的审稿过程中，审稿人要求马涵慧团队就自己的系统和刘如谦的系统之间编辑效率进行详细的比较。

他说：“我们发现大部分位点 sPEs 的编辑效率优于 epegRNAs 系统。同时我们的 SnPEs 和埃里克·桑蒂默实验室的 split prime editor 各有千秋，SnPEs 系统改造出了更多的 RNA 适配体版本，不同版本选择对不同位点效率的提高有所不同，SnPE 提高小片段插入和缺失方面效果明显。

也就是说我们的系统可以更好地构建诱导型先导编辑系统(iPEs)，让基因编辑系统变得更加安全可控。”

基因成像技术和基因编辑技术的完美结合

可以说，此次研究立项的根本在于治疗基因型的疾病，例如基因组中序列的插入、缺失或突变。

然而，已有的基因组编辑工具都存在编辑效率和特异性不可兼得的局限性，而先导编辑器很好的突破了这些局限，所以才选择了这样一个工具。

在尝试阶段，他们一开始就发现先导编辑器在绝大部分基因位点上都很难编辑，于是就从探索先导编辑的分子机制和先导编辑器系统改造同时开展。

该团队推测，效率低可能和 Cas9-pegRNA 复合物的组装和对目标 DNA 的靶向能力有关。

于是，课题组就从如何提高 Cas9-pegRNA 复合物组装能力和 Cas9-pegRNA 复合物对 DNA 靶向能力入手。

当时走了很多弯路，一开始和刘如谦实验室一样在研究 pegRNA 的稳定性，用高通量测序和 RNA FISH 等手段分析后发现，完整的 pegRNA 仍然是主要产物。

所以，该团队认为 pegRNA 的稳定性可能不是影响先导编辑器效率的主要原因，后来实验也进一步证明了先导编辑系统的 DNA 靶向效率低才是主因。

至于 sPEs 为什么可以提高靶向效率和编辑效率仍需进一步研究，其猜测可能和结构的动态变化有关，使得先导编辑器系统的靶向效率得到恢复。

另据悉，马涵慧团队前期的工作主要集中在基于 CRISPR 的 DNA 和 RNA 成像技术，活细胞中 CRISPR 系统分子动力学、表观遗传与染色质高级结构研究中，所以团队需要摸索出一套基因编辑的分析系统。

“我们也很幸运地得到麻省大学医学院刘朋朋老师鼎力相助，不但帮我们分析数据，还教会了同学们如何分析编辑效率和脱靶效应等，使得我们后续的工作进展非常顺利，目前还有多个正在进行的基因编辑相关的课题也因此得益。”他说。

前路虽光明，任重又道远

在一开始打算做这个课题的时候，团队内部并没有基因编辑相关课题，也没有一套完整的基因编辑相关的研究和分析系统，导致实验结果总是不稳定，这让他们无法下任何实质性结论。

为了构建比较好的系统，学生们请教了很多做基因编辑的课题组，最后慢慢摸索这才构建出一个非常适合先导编辑器的系统，为后续研究铺平了道路，目前他们已经有 5-6 个先导编辑器相关的课题在同时进行。

马涵慧说：“这让我们深刻体会到一个好的系统对于实验或实验室的重要性。在我们构建好系统之后，发现所有的质粒都需要构建。为了争取时间，一次性做上百个克隆质粒 DNA 就变成常有的事。虽然很辛苦，但同学们看到好的结果时都挺欣慰的。这是我们实验室对基因编辑工具开发的初次尝试，也希望下一个更加精彩的工作很快能和大家见面。”

此次论文发表后，课题组又基于 SnPEs 系统进一步设计了诱导型先导编辑器(inducible PEs， iPEs)。其结合 RNA 适配体的蛋白与 Cas9 分开，在二者上分别连接可诱导结合的元件，通过药物、红外光照或超声诱导二者结合，进而将 pRNA 拉至编辑位点附近发挥作用。

目前，该团队也正在尝试药物、红外光照或超声诱导基因表达或蛋白相互作用，以实现高效、安全可控的诱导型先导编辑器。

此外，他们还打算将 sPEs 或 tPEs 系统通过脂质纳米粒或腺相关病毒递送到小鼠体内，在个体水平上进行疾病的治疗。

由于先导型编辑器所涉及的蛋白质构建体太大，因此很难通过单个腺相关病毒载体递送全长蛋白质复合体的过程。

因此，后续其还会优化先导型编辑器复合体的大小，直到适合单个腺相关病毒载体递送。

虽然说先导编辑器为许多遗传性疾病的治疗带来了希望，然而要将其真正应用到临床上还为时尚早。

出于基因安全性的考虑，先导编辑器还要经历很多改造，并且需要将这种编辑器用于各种不同类型的细胞，比如与治疗相关的原代细胞或者干细胞，同时需要考虑到对脱靶效应、免疫反应等的医学评价。

所以在使用先导编辑器治疗罕见疾病之前，还有很长的一段路要走。在细胞水平的尝试只是一个起点，后续需要在模型动物中探索递送、编辑效率、脱靶效应、免疫反应等各个方面的研究。

总而言之，先导型编辑是罕见病基因组编辑疗法领域的一颗“新星”，如何在提供更精确的碱基编辑能力和更高的效率的同时，保证基因治疗的安全性，是马涵慧团队需要继续思考和研究的问题。